Una serie di vettori e ceppi per l'integrazione cromosomica nel lievito di fissione

Nov 30, 2023

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 9295 (2023) Citare questo articolo

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L'espressione di geni eterologhi è una tecnica importante nella genetica del lievito. Nel lievito a fissione, i geni leu1 e ura4 sono stati utilizzati principalmente come marcatori selezionabili per l'espressione eterologa. Per espandere il repertorio di marcatori di selezione disponibili per l'espressione eterologa di geni, qui abbiamo sviluppato nuovi sistemi vettore ospite che impiegano lys1 e arg3. Utilizzando l'editing del genoma con il sistema CRISPR/Cas9, abbiamo isolato diversi alleli di lys1 e arg3, ciascuno con una mutazione critica nella regione ORF. Parallelamente, abbiamo sviluppato una serie di vettori che completano l'auxotrofia degli amminoacidi dei mutanti lys1 e arg3 quando integrati in ciascun locus. Utilizzando questi vettori in combinazione con il vettore di integrazione pDUAL precedentemente sviluppato, abbiamo osservato con successo la localizzazione simultanea di tre proteine ​​in una cellula fondendole con diverse proteine ​​fluorescenti. Pertanto, questi vettori consentono l'espressione combinatoria di geni eterologhi, che affronta sfide sperimentali sempre più diversificate.

Lo studio della biologia del lievito ha stimolato lo sviluppo di sofisticati sistemi sperimentali per chiarire i meccanismi molecolari alla base di una varietà di fenomeni biologici. Recentemente, per esplorare questi meccanismi molecolari più a fondo, sono talvolta necessari sistemi sperimentali complicati. In molti casi, un esperimento così complicato richiede l'espressione di più transgeni in una cellula. A questo scopo sono stati sviluppati numerosi vettori, che possono essere utilizzati come plasmidi episomali o vettori integrativi, e promotori costitutivi o inducibili1, 2. Sono preferiti sistemi di espressione in grado di riprodurre condizioni simili agli ambienti fisiologici. In questo senso, l'uso di vettori integrativi è uno dei sistemi all'avanguardia utilizzati nella biologia del lievito piuttosto che i vettori episomiali3.

Abbiamo precedentemente sviluppato due tipi di vettori episomali che possono essere utilizzati anche per l'integrazione cromosomica mediante ricombinazione crossover singola4, 5. Un tipo di vettore è progettato per essere integrato nei loci lys1, arg1 o his3. Quando questi vettori vengono integrati con successo nei loci bersaglio, i trasformanti diventano auxotrofi per gli amminoacidi corrispondenti. Il merito di questi vettori è che possono essere utilizzati per ceppi privi di auxotrofia di aminoacidi. Pertanto, in molti casi, questi vettori possono essere utilizzati senza preparare un nuovo ceppo ospite. Tuttavia, il fatto che l'integrazione dei vettori nel genoma determini un'auxotrofia degli amminoacidi è in alcuni casi uno svantaggio. D'altra parte, i vettori della serie pDUAL sono progettati per l'integrazione nel locus4 leu1. Sebbene possano essere utilizzati solo per ceppi aventi l'allele leu1-32, i trasformanti diventano prototrofi per la leucina, consentendo una facile selezione dei trasformanti (Fig. 1). Il fatto che i vettori pDUAL non contengano una copia funzionale del gene leu1 evita la selezione di trasformanti in cui i plasmidi sono integrati casualmente nel genoma. Sebbene entrambi i tipi di vettori abbiano i propri vantaggi e svantaggi, i vettori di tipo pDUAL sembrano più utili dal punto di vista della selezione e del mantenimento di trasformanti adeguati.

Integrazione di pDUAL nel genoma del mutante leu1-32. I vettori della serie pDUAL hanno una parte del gene leu1 contenente siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione all'interno della regione ORF leu1. Quando si verifica una singola ricombinazione crossover a valle del punto di mutazione dell'allele leu1-32, si prevede che il genoma risultante abbia due copie di leu1, una a cui manca la parte 3' e l'altra che è un gene funzionale a lunghezza intera. Lo schema non è in scala.

In questo articolo, prendendo in considerazione la strategia della ricombinazione crossover singola di tipo pDUAL, abbiamo cercato di sviluppare nuovi sistemi vettore ospite mirati a loci diversi da leu1. Utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 recentemente sviluppato nel lievito di fissione6, abbiamo isolato con successo ceppi con mutazioni frameshift critiche in lys1 o arg37, 8. Abbiamo anche costruito vettori che potrebbero completare l'auxotrofia degli amminoacidi di questi mutanti dopo l'integrazione mirata nel cromosoma. Insieme ai vettori pDUAL precedentemente sviluppati, è ora disponibile l'espressione di tre transgeni nei trasformanti prototrofi senza l'utilizzo di marcatori resistenti ai farmaci.